Nuevas fórmulas ‘made in Spain’ para diagnosticar el SARS-CoV-2

José F. Ruiz

La pandemia del covid-19, la enfermedad causada por coronavirus SARS-CoV-2, ha provocado una crisis global con un alto costo en vidas humanas. Las consecuencias económicas esperadas son igualmente extraordinarias. Debido a su novedad, actualmente no existen vacunas contra el virus, ni tratamientos que se puedan aplicar a pacientes con covid-19.

La importancia del diagnóstico

A mediados de marzo, con más de 100.000 infectados en todo el mundo y miles de muertes, la Organización Mundial de la Salud declaró la pandemia. Unos días después, su director aseguró que la mejor forma de frenar su avance era promover el diagnóstico de los infectados: “Tenemos un mensaje sencillo para todos los países: prueba, prueba, prueba. Pruebe todos los casos sospechosos. “

El principal diagnóstico molecular del SARS-CoV-2 implica la detección de su material genético, una molécula de ácido ribonucleico (ARN) lineal. Estas moléculas, como las de ácido desoxirribonucleico (ADN), son secuencias más o menos largas de unidades químicas llamadas nucleótidos. Estos están unidos por enlaces químicos, como si fueran los eslabones de una cadena, gracias a la actividad de unas enzimas llamadas ADN polimerasas.

Una diferencia fundamental entre estos dos tipos de ácidos nucleicos es que, mientras que el ARN está formado por una sola hebra, el ADN suele estar formado por dos hebras, que se entrelazan como en un sistema de cierre de cremallera.

Métodos actuales

La detección del SARS-CoV-2 no es fácil en la práctica. Primero, la cantidad de ARN en los individuos infectados es mínima, especialmente en las primeras etapas de la infección. Por esta razón, un diagnóstico exitoso requiere técnicas poderosas para amplificar el genoma del virus.

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La más utilizada en la actualidad es la denominada RT-PCR, una técnica compleja que requiere dos etapas (ver figura, panel izquierdo).

  1. En el primero, el genoma de ARN del virus se convierte en una molécula de ADN de doble hebra mediante el uso de la enzima. RetroTranscriptasa.

  2. En el segundo, este ADN se utiliza como molde en una reacción en cadena (PCR). Reacción en cadena de la polimerasa) que le permite generar millones de copias de una parte de su secuencia. Esto se logra gracias a la actividad de una ADN polimerasa resistente a altas temperaturas y la adición de nucleótidos al tubo de ensayo donde se encuentra el ADN.

La abundancia de ADN sintetizado se puede medir fácilmente en tiempo real. Para profundizar un poco más en esta técnica, recomiendo este artículo reciente:

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Esquema comparativo de los dos métodos de diagnóstico molecular del ARN del coronavirus SARS-CoV-2. A la izquierda, método de RT-PCR. A la derecha, un nuevo método que propone el uso de la ADN polimerasa del fago phi29 y sondas de candado. Ambos procedimientos requieren la purificación previa de ARN viral de muestras tomadas del paciente.

Imaginación en tiempos de pandemia

La necesidad de técnicas de diagnóstico más fáciles, rápidas y, por supuesto, económicas ha estimulado a los científicos de todo el mundo. Entre ellos, un grupo de investigadores españoles ha propuesto recientemente una novedoso método de amplificación del genoma del SARS-CoV-2.

Este método se basa en el uso de una enzima alternativa, la ADN polimerasa del virus bacteriano 29 (phi29pol). Esta pequeña proteína, descubierta y caracterizada por los investigadores Luis Blanco y Margarita Salas, representa el paradigma del éxito que se puede lograr invirtiendo en investigación básica.

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Gracias a estos estudios, la enorme capacidad del phi29pol para sintetizar ADN utilizando un mecanismo de “círculo rodante” (figura, panel derecho). En este mecanismo, la polimerasa solo necesita una molécula de ADN circular monocatenaria, que utilizará como plantilla, y un cebador al que añadir los nuevos nucleótidos.

La importancia de cerrar los candados

Pero, ¿cómo se convierte el ARN del SARS-CoV-2 en una molécula de ADN circular? Gracias a la capacidad de las moléculas de ácido nucleico para formar híbridos entre sí cuando sus secuencias de nucleótidos son complementarias y el uso de pequeñas moléculas de ADN llamadas sondas de candado (De Inglés sondas de candado). Estas sondas son un recurso de amplificación de ADN molecular ideado en el pasado para identificar ciertos patógenosincluyendo algunos virus.

Por tanto, se pueden diseñar sondas de candado ADN con una secuencia de nucleótidos en sus extremos que se une específicamente a dos secuencias contiguas en el ARN del virus (figura, ❶). Los dos extremos del sonda de candado emparejados con el ARN viral, están conectados por una secuencia intermedia que permanece libre, de modo que la sonda adopta una forma circular de “cerradura abierta” (❶). Este círculo abierto se puede sellar utilizando otra proteína, común en cualquier laboratorio de biología molecular, llamada ADN ligasa. Así, se obtiene un “candado cerrado” (❷), que no es más que una pequeña molécula de ADN circular monocatenaria.

Replicación del círculo rodante

Una vez que se genera ese ADN circular, el phi29pol puede usarlo como plantilla para sintetizar ADN. Para ello, se encarga de enganchar los nuevos nucleótidos a uno de los extremos del ARN viral que aún está emparejado con la sonda circular (❸). En esta reacción de síntesis de ADN, la polimerasa da vueltas y vueltas a la plantilla circular de ADN, de ahí el parecido con un “círculo rodante” (❹).

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La capacidad de sintetizar phi29pol es prácticamente inigualable, por lo que se pueden producir grandes cantidades de ADN. También se pueden usar diferentes tipos de moléculas fluorescentes para detectar ADN recién sintetizado, como en RT-PCR. Por tanto, al acoplar la reacción de amplificación a un sistema de detección de fluorescencia, es posible saber si la muestra analizada contenía ARN viral o no.

Ventajas de la nueva metodología

La gran ventaja de la nueva propuesta basada en el uso de phi29pol y sondas de candado es su sencillez y su rapidez. Es una reacción que tiene lugar a temperatura constante (reacción isotérmica) y no requiere mucho equipo. El método de RT-PCR es, en comparación, mucho más complejo y requiere numerosos ciclos de aumento y disminución de la temperatura. Esto es posible gracias al uso de termocicladores, máquinas bastante complejas y costosas que están disponibles de forma limitada en hospitales y centros de investigación.

Por sus características, el nuevo método facilitaría el diagnóstico masivo de personas infectadas. Se podría realizar en centros de salud, ya que no necesita grandes infraestructuras ni personal altamente especializado. Además, sería particularmente útil en países menos desarrollados, donde la disponibilidad de equipo e infraestructura es limitada.

José F. Ruiz, Catedrático de la Universidad en el Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla, Universidad de Sevilla

Este artículo fue publicado originalmente en La conversación. leer el original.

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